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介紹一個(gè)常用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)~

(相關(guān)資料圖)

利用熒光素酶與底物結(jié)合發(fā)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的特點(diǎn)，把感興趣的基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控元件克隆在螢火蟲熒光素酶基因（firefly luciferase）的上游，構(gòu)建成熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒。然后轉(zhuǎn)化煙草，測(cè)定熒光素酶活性。通過熒光素酶活性的高低判斷性刺前后或不同刺激對(duì)感興趣的調(diào)控元件的影響。為了減少內(nèi)在的變化因素對(duì)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性的影響，將帶有海腎熒光素酶基因（Rinilla luciferase)的質(zhì)粒作為對(duì)照質(zhì)粒與報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化，提供轉(zhuǎn)錄活力的內(nèi)對(duì)照，使測(cè)試結(jié)果不受實(shí)驗(yàn)條件變化的干擾。

技術(shù)背景

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熒光素酶生物檢測(cè)技術(shù)誕生于1990年，已有30年的發(fā)展史。單熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)到雙熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)的發(fā)展，為科研人員提供了更為嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)手段。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)在原有的基礎(chǔ)上引入了海腎報(bào)告基因，可以排除不同組之間細(xì)胞生長(zhǎng)狀況、細(xì)胞數(shù)目以及轉(zhuǎn)染效率帶來的干擾，起到校正的作用，從而使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更為可靠。

什么是雙熒光素酶？

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雙熒光素酶通常是指螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素。其中熒火蟲熒光素是從螢火蟲中分離得到，分子量為61 kDa；而海腎（Renilla）熒光素酶則是從海腎（Renilla reniformis）中分離，分子量為36 kDa。

兩種熒光素酶的區(qū)別是什么？

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①底物和輔因子不同：螢火蟲熒光素酶需要熒光素、氧氣、ATP和鎂離子同時(shí)存在才能發(fā)光；而海腎熒光素酶僅需要腔腸素（coelenterazine）和氧氣。

②發(fā)光的顏色不同：螢火蟲熒光素酶產(chǎn)生的光顏色呈現(xiàn)黃綠色，波長(zhǎng)550-570nm；而海腎熒光素酶產(chǎn)生藍(lán)光，波長(zhǎng)480nm。正是由于這兩種酶的底物和發(fā)光顏色不同，所以在雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)中得到廣泛應(yīng)用，它們的發(fā)光原理如下所示：

實(shí)驗(yàn)原理

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Firefly luciferase和Renilla luciferase之所以被稱為報(bào)告基因，是因?yàn)樵诨虮磉_(dá)調(diào)控研究時(shí)，利用兩者表達(dá)產(chǎn)生的熒光比值可以監(jiān)控、證實(shí)微觀層面上的分子間的相互作用。具體做法是：將靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件或5’啟動(dòng)子區(qū)克隆在Firefly luciferase基因的上游，或把3’-UTR區(qū)或lncRNA結(jié)合序列克隆在Firefly luciferase基因的下游，以研究啟動(dòng)子的強(qiáng)弱和轉(zhuǎn)錄因子對(duì)啟動(dòng)子的作用或miRNA對(duì)目的基因或lncRNA的調(diào)控作用（見圖2）。與此同時(shí)，引入包含Renilla luciferase基因的TK載體作為內(nèi)參，以便消除細(xì)胞轉(zhuǎn)染等因素帶來的組間誤差。

Dual Luciferase Reporter實(shí)驗(yàn)步驟

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以煙草為材料進(jìn)行Dual Luciferase Reporter的實(shí)驗(yàn)步驟：

1）構(gòu)建相應(yīng)的載體。

2）挑取轉(zhuǎn)化有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌單菌落，接種到2 mL LB液體培養(yǎng)基（添加相應(yīng)抗生素）中，28℃ 220 rpm培養(yǎng)過夜。

3）農(nóng)桿菌培養(yǎng)至OD600為1.0，1700× g離心5 min收集菌體后，用1/2MS液體培養(yǎng)基清洗菌體2次；用含有150 μmol/L乙酰丁香酮的1/2MS液體培養(yǎng)基將農(nóng)桿菌的OD600調(diào)至1.0。

4）將待檢測(cè)的農(nóng)桿菌菌液進(jìn)行混合，使每種菌液的OD600為0.5。

5）選取生長(zhǎng)期為1個(gè)月左右完全伸展的煙草葉片，將混合好的菌液用1 mL注射器(去掉針頭)從煙草葉背面進(jìn)行注射。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一致性，需要將對(duì)照載體和待檢測(cè)目標(biāo)載體的菌液注射在同一葉片的不同部位上, 以保證相同的生長(zhǎng)背景。

6）正常溫室生長(zhǎng)條件下，24-48 h即可取樣觀察。

7）取3-4片直徑為6-8 mm的葉盤，放入2 mL的EP管（提前放入3-4個(gè)小鋼珠）中，液氮中冷凍，使用破碎儀進(jìn)行研磨破碎（45 Hz，30 s）。破碎完全后在EP管中加入100 μL裂解液。

8）冰上孵育5 min左右，充分裂解葉片。

9）10000-16000 rpm離心1 min，取上清。

10）熒光檢測(cè)：

①取20 μL裂解液，加至培養(yǎng)板中。按照實(shí)驗(yàn)需要，可設(shè)置3孔-5孔重復(fù)。

②配制螢火蟲螢光素酶反應(yīng)工作液和海腎螢光素酶反應(yīng)液，即螢火蟲螢光素酶底物（50 ×）和海腎螢光素酶底物（50×）。

分別用對(duì)應(yīng)的緩沖液稀釋至1×工作液。并孵育至室溫。

③加入100 μL螢火蟲螢光素酶反應(yīng)液，震板混勻，檢測(cè)螢火蟲螢光素酶的活力，檢測(cè)盡量在30 min內(nèi)完成。

④加入100 μL海腎螢光素酶反應(yīng)液，震板混勻，檢測(cè)海腎螢光素酶的活力，檢測(cè)盡量在30 min內(nèi)完成。

熒光素酶報(bào)告基因的特點(diǎn)

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1、優(yōu)越的靈敏度，比Western bloting靈敏度高1000倍以上；

2、內(nèi)源性低，無內(nèi)源性表達(dá)；

3、熒光素酶檢測(cè)不受細(xì)胞內(nèi)其他物質(zhì)影響；

4、發(fā)光檢測(cè)，檢測(cè)方便；

5、靈敏度高，1020摩爾熒光素酶分子；

6、檢測(cè)范圍廣，大于7個(gè)數(shù)量級(jí)。

主要應(yīng)用領(lǐng)域

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1、潛在啟動(dòng)子/啟動(dòng)子核心區(qū)域檢測(cè)；

2、潛在增強(qiáng)子/抑制子等調(diào)控子核心元件檢測(cè)；

3、啟動(dòng)子區(qū)可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)檢測(cè)；

4、啟動(dòng)子/增強(qiáng)子與轉(zhuǎn)錄因子的相互作用；

5、病毒/細(xì)胞相互作用；

6、物理化學(xué)等誘導(dǎo)因素對(duì)啟動(dòng)子活性的調(diào)節(jié)（抑制或增強(qiáng)）；

參考文獻(xiàn)

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